Bệnh viện Y Dược Huế

Nghiên cứu khả năng sao mã của gene qui định thụ thể của yếu tố phát triển biểu mô (egfr) trong bệnh ung thư biểu mô tuyến vú bằng kỹ thuật rt-pcr

EGFR là một thành viên của họ EGFR- những receptor tyrosine kinase xuyên màng type I, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể bằng cách điều hòa cả quá trình biệt hóa và tạo hình thái của tế bào và mô. Tuy nhiên, EGFR thường biểu lộ quá mức và chính sự biểu lộ sai lạc này cùng với con đường tín hiệu mà nó khởi động đã gây ra sự phát triển không giới hạn và quá trình tăng sinh không kiểm soát trong các khối u ác tính bao gồm ung thư biểu mô tuyến vú (UTBM), một trong những ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ.

Hồ Hoàng Thị Kim Huệ, Hà Thị Minh Thi, Phan Thị Minh Phương

Đại học Y Dược Huế 

Tóm tắt

Đặt vấn đề: EGFR là một thành viên của họ EGFR- những receptor tyrosine kinase xuyên màng type I, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể bằng cách điều hòa cả quá trình biệt hóa và tạo hình thái của tế bào và mô. Tuy nhiên, EGFR thường biểu lộ quá mức và chính sự biểu lộ sai lạc này cùng với con đường tín hiệu mà nó khởi động đã gây ra sự phát triển không giới hạn và quá trình tăng sinh không kiểm soát trong các khối u ác tính bao gồm ung thư biểu mô tuyến vú (UTBM), một trong những ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ.

Mục tiêu: (1) Đánh giá mức độ sao mã của gene qui định thụ thể yếu tố phát triển biểu mô trong mẫu mô ung thư biểu mô tuyến vú bằng kỹ thuật RT-PCR. (2) So sánh mức độ sao mã của gene qui định EGFR trong ung thư biểu mô tuyến vú với u xơ tuyến vú.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:  70 mẫu mô bao gồm 38 mẫu mô UTBM tuyến vú và 32 mẫu u xơ tuyến vú được tách chiết RNA tổng số. Kỹ thuật RT-PCR bán định lượng khuếch đại gene mã hóa EGFR ở mô UTBM và mô u xơ tuyến vú bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu gene EGFR. Sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2% .

Kết quả nghiên cứu: nồng độ RNA tổng số trong mô UTBM tuyến vú là 170.03 ± 201.12 ng/µl, cao hơn so với mô u xơ tuyến vú: 65.96 ± 43.16 ng/µl (p<0.05). Nồng độ cDNA trung bình trong UTBM tuyến vú là 2495.72 ± 1072.55 ng/µl (p>0.05).  Tỷ lệ nồng độ DNA trung bình sau phản ứng RT-PCR của gene EGFR/GAPDH trong UTBM tuyến vú là 1.22 ± 0.24, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với u xơ tuyến vú:0 75 ±0.19 (p<0.0001). Điểm cắt của tỷ lệ EGFR/GAPDH :0.97, diện tích dưới đường cong ROC: 0.913, p<0.0001, độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 81.58% và 93.75%.

Kết luận: mức độ sao mã của gene EGFR trong UTBM tuyến vú tăng cao gấp 1.63 lần so với u xơ tuyến vú. Điểm cắt của tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng của gene EGFR/GAPDH: 0.97, độ nhạy: 81.58% và độ đặc hiệu: 93.75%.

Từ khóa: EGFR, RT-PCR, ung thư biểu mô tuyến vú

Abstract

STUDY ON TRANSCRIPTION POSSIBILITY OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) GENE IN BREAST CARCINOMA TISSUES BY REVERSE TRANSCRIPTION-PCR ASSAY

            Ho Hoang Thi Kim Hue, Ha Thi Minh Thi, Phan Thi Minh Phuong

Hue University of Medicine and Pharmacy

Background: EGFR is a member of the EGFR family- type I transmembrane tyrosine kinase receptors, which play an essential role in organ development and growth by regulating both the differentiation and morphology of cells and tissues. However, EGFRs are frequently overexpressed , and this aberrant expression and the signaling event it elicits induce erroneous development and unrestricted proliferation in a number of human malignancies including breast carcinoma, one of the most common cancer in women. Objective:(1)Evaluating transcription level of EGFR gene in breast carcinoma tissues by RT-PCR assay. (2) Comparing transcription level of EGFR gene in breast carcinoma with breast fibroadenoma. Subject and Methods: total RNA from 70 samples including 38 breast carcinoma tissues and 32 breast fibroadenoma tissues were extracted. EGFR transcription level were determined using semiquantitative Reverse Transcription-PCR assay. PCR products were tested by electrophoresis on agarose gel 2%. Results: RNA total concentration in breast carcinoma tissues was 170.03 ± 201.17 ng/µl, was significantly higher in breast fibro adenoma tissue: 65.96 ± 43.16 ng/µl (p<0.05) . EGFR transcription level was highly expressed in breast carcinoma compared to breast fibro adenoma (1.22 ± 0.24 compared to 0.75 ± 0.19) (p< .0001). The cut-off point of the rate EGFR/GAPDH: 0.97, area under the curve: 0.913, p< 0.0001, sensitivity and specificity were 81.58% and 93.75%. Conclusion: Transcription level of EGFR gene in breast carcinoma was significantly 1.63 times higher in breast fibro adenoma. The cut-off point of the rate EGFR/GAPDH: 0.97, sensitivity: 81.58% and specificity: 93.75%.

Key words: EGFR, RT-PCR, breast carcinoma

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

EGFR là một thành viên của họ EGFR- những receptor tyrosine kinase xuyên màng type I, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể bằng cách điều hòa cả quá trình biệt hóa và tạo hình thái của tế bào và mô. Tuy nhiên, EGFR thường biểu lộ quá mức và chính sự biểu lộ sai lạc này cùng với con đường tín hiệu mà nó khởi động đã gây ra sự phát triển không giới hạn và quá trình tăng sinh không kiểm soát trong các khối u ác tính bao gồm ung thư biểu mô tuyến vú. Ung thư biểu mô tuyến vú là u tân sinh ác tính ở tuyến vú. Đây là loại ung thư thường gặp nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ trên thế giới. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm hai mục tiêu: (1) Đánh giá mức độ sao chép của gene qui định thụ thể yếu tố phát triển biểu mô trong mẫu mô ung thư biểu mô tuyến vú bằng kỹ thuật RT-PCR. (2) So sánh mức độ sao chép của gene qui định EGFR trong ung thư biểu mô tuyến vú với u xơ tuyến vú.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nhóm bệnh: 38 mẫu mô tuyến vú của bệnh nhân UTBM tuyến vú được chẩn đoán xác định bằng kết quả mô bệnh học tại khoa Giải Phẫu Bệnh, Bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung Ương Huế từ tháng 4/2012 đến tháng 7/2013.

Nhóm chứng: 32 mẫu mô tuyến vú của bệnh nhân mắc bệnh u xơ tuyến vú được chẩn đoán xác định bằng kết quả mô bệnh học tại khoa Giải Phẫu Bệnh, Bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung Ương Huế từ tháng 4/2012 đến tháng 7/2013.

2.2.Phương pháp nghiên cứu:

Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang dùng thử nghiệm in vitro có đối chứng.

Các bước thực hiện: tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng kit Phenol/Chloroform, sau đó tổng hợp cDNA bằng bộ kit của công ty Việt Á. Kỹ thuật RT-PCR bán định lượng khuếch đại gene mã hóa EGFR ở mô UTBM và mô u xơ tuyến vú bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu gene EGFR. Đồng thời, gene nội chuẩn GAPDH được sử dụng để đánh giá chất lượng mẫu trong mỗi phản ứng. Sản phẩm sau phản ứng RT-PCR được điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra, và đo nồng độ DNA. Tính tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng của gene EGFR/GAPDH, sử dụng thuật toán về đường cong ROC để tính giá trị điểm cắt, độ nhạy và độ đặc hiệu.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.Nồng độ RNA tổng số (RNA total) và độ tinh sạch RNA (Tỷ số A260/A280)

Bảng 1. Nồng độ RNA trung bình sau tách chiết

Nhóm

Nhóm chứng

Nhóm bệnh

p=0,006

Nồng độ RNA tổng số trung bình(ng/µl)

65,96

170,03

Độ lệch chuẩn

± 43,16

± 201,70

 

Bảng 2. Tỷ số A260/A280 trung bình kiểm tra sau tách chiết

Nhóm

Nhóm chứng

Nhóm bệnh

p=0,938

Tỷ số A260/A280 trung bình

2,01

2,02

Độ lệch chuẩn

± 0,75

± 0,12

Nhận xét:Sự khác biệt về nồng độ RNA tổng số trung bình giữa nhóm chứng và của nhóm bệnh có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Hầu hết các mẫu trong nghiên cứu đều đạt độ tinh sạch từ 1,8- 2,0.

3.2. Nồng độ DNA bổ sung (cDNA)

Bảng 3. Nồng độ cDNA trung bình sau khi tổng hợp

Nhóm

Nhóm chứng

Nhóm bệnh

 

p=0,572

Nồng độ cDNA trung bình(ng/µl)

2595,72

2472,29

Độ lệch chuẩn

± 1072,55

± 739,29

Nhận xét:Sự khác biệt về nồng độ cDNA giữa nhóm chứng và nhóm bệnh không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

3.3. Kết quả sao mã mRNA của gene EGFR trên mô u xơ tuyến vú và mô UTBM tuyến vú

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu với gene EGFR tiến hành phản ứng RT-PCR và nested-PCR bán định lượng trên các mẫu RNA tổng số tách chiết từ những mô bệnh vú lành tính và mô UTBM tuyến vú để xác định mức độ sao mã của gene EGFR. Sản phẩm được điện di trên gel agasose 2% có kích thước 322bp. Đồng thời, gene GAPDH cũng được khuếch đại. Kết quả cho thấy tất cả các bệnh nhân trong nghiên cứu đều có chất lượng mRNA tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng. Sản phẩm cũng được điện di trên gel agasose 2% có kích thước 350bp.

EGFR 322 bp


GAP 350p

Hình 1. Kết quả phản ứng RT- PCR của gene EGFR và gene GAPDH trên mẫu mô u xơ tuyến vú và ung thư biểu mô tuyến vú. Sản phẩm được khuếch đại từ cDNA của mẫu mô u xơ tuyến vú (1- 3), mô ung thư biểu mô tuyến vú (4- 7), T: thước 100bp, A: chứng âm nước cất.

Nhận xét: Đậm độ vạch sản phẩm điện di ở các mẫu mô UTBM tuyến vú xuất hiện rõ hơn nhiều so với mẫu tách từ mô u xơ tuyến vú. Gene EGFR được tăng cường sao mã ở mô UTBM tuyến vú trong khi sản phẩm sao mã của nó lại được phát hiện rất ít trên mô u xơ tuyến vú.

3.4. Kết quả RT-PCR bán định lượng so sánh mức độ sao mã của gene EGFR ở mô UTBM tuyến vú và mô u xơ tuyến vú

Chúng tôi tiến hành đo nồng độ DNA sau phản ứng khuếch đại gene EGFR và GAPPH bằng máy Nanodrop 2000. Mức độ sao mã của gene EGFR ở mô ung thư và mô đối chứng được tính bằng tỉ lệ nồng độ DNA sau phản ứng EGFR/GAPDH và sau đó vẽ đồ thị.

EGFR

Hình 2. Kết quả phản ứng RT-PCR của gene EGFR trên bệnh u xơ tuyến vú và UTBM tuyến vú. Sản phẩm được khuếch đại từ cDNA của mô u xơ tuyến vú (1- 3) và mô UTBM tuyến vú (4- 8). T:Thước 100 bp.

Bảng 4. Mức độ sao mã của gene EGFR ở mô UTBM tuyến vú và mô u xơ tuyến vú

Nhóm

Nhóm  chứng

Nhóm bệnh

Số trường hợp

32

38

Tỉ lệ EGFR/GAPDH trung bình

0,75

1,22

Độ lệch chuẩn

± 0,19

± 0,24

p < 0,0001

Nhận xét: Tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng PCR của gen EGFR/GAPDH ở nhóm UTBM tuyến vú là 1,22 ± 0,24 cao hơn tỷ lệ này ở nhóm u xơ tuyến vú là 0,75 ± 0,19. Sự khác biệt về khả năng sao chép của gene EGFR giữa nhóm bệnh và nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Biểu đồ 1. So sánh sự sao mã của EGFR ở mô UTBM tuyến vú và mô u xơ tuyến vú.

3.5. Kết quả tính cut-off (ngưỡng) của RT-PCR bán định lượng gen EGFR

Đặt giả thiết Ho là không có sự khác biệt giữa hai nhóm UTBM tuyến vú và u xơ tuyến vú

Ho gen EGFR (u xơ tuyến vú =0) = gen EGFR (UTBM tuyến vú = 1)

Sử dụng thuật toán về đường cong ROC. Trên phầm mềm MedCal 12.7 tính toán về điểm cắt (cut-off point), độ nhạy và độ đặc hiệu

Ta có với điểm cắt: Tỷ EGRR/GAPDH= 0,97; độ nhạy: 81,58%; độ đặc hiệu:93,75%. Ứng với chỉ số Jouden J= 0,7533. Diện tích dưới đường cong ROC (AUC): 0,913 thỏa mãn >0,80.

Với p< 0,0001 ta bác bỏ giả thiết Ho nghĩa là có sự khác biệt về tỷ số EGFR/GADPH giữa nhóm u xơ tuyến vú và nhóm bệnh UTBM tuyến vú.

Hình 3. Đường cong ROC về tỷ lệ nồng độ gene EGFR/GADPH

Như vậy:    Tỷ số EGFR/GAPDH< 0,97: không nghĩ đến ung thư.

                   Tỷ số EGFR/GAPDH ≥ 0,97: nghĩ đến ung thư.

4. BÀN LUẬN

4.1. Nồng độ RNA tổng số và độ tinh sạch của RNA

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật tách chiết RNA tổng số được tiến hành bằng quy trình sử dụng Phenol/Chloroform của Công ty Việt Á. Quy trình của bộ kít này đơn giản, dễ tiến hành, giá thành tương đối rẻ, tuy hơi độc cho người thao tác nhưng lại tách RNA tổng số rất ổn định. Các mẫu RNA tổng số tách chiết được từ các mẫu mô bệnh phẩm tuy có nồng độ khác nhau nhưng vẫn đảm bảo cho phản ứng tổng hợp cDNA.

Kết quả ở bảng 1 cho thấy nồng độ cDNA tổng số trung bình ở nhóm chứng là 65,96 ± 43,16 (ng/µl) và ở nhóm bệnh là 170,03 ± 201,70 ng/µl. Nồng độ RNA tổng số trung bình ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng và có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Điều này có lẽ do những mẫu mô ung thư đa phần đều bị hoại tử mũn nát nên dễ nghiền hơn so với những mẫu mô u xơ tuyến vú nên mẫu mô rất dai chắc.

Đồng thời, chất lượng RNA được kiểm tra bằng phương pháp đo quang dựa trên tỷ lệ của sự hấp thụ tại bước sóng 260 và 280nm (A260/A280). Kết quả từ bảng 2 cho thấy tỷ số A260/A280 trung bình ở nhóm chứng là 2,01 ± 0,75, và ở nhóm bệnh là 2,02 ± 0,12. Sự khác biệt về tỷ số A260/A280 giữa nhóm chứng và nhóm bệnh không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Hầu hết đa phần các mẫu RNA tổng số trong nhóm chứng và nhóm bệnh đều đạt độ tinh sạch từ 1,8 – 2,0.

4.2. Nồng độ DNA bổ sung

Sau khi tổng hợp cDNA, các mẫu cDNA được kiểm tra nồng độ bằng máy Nanodrop 2000 của hãng Thermo Scientific. Kết quả ở bảng 3 cho thấy nồng độ cDNA trung bình ở nhóm chứng là 2595,72 ± 1072,55 ng/µl và ở nhóm bệnh là 2472,29 ± 739,29 ng/µl. Sự khác biệt về nồng độ cDNA của nhóm chứng và nhóm bệnh không có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Chất lượng cDNA tổng hợp còn được kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng gene nội kiểm chuẩn GAPDH. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu cDNA đều đảm bảo chất lượng cho các phản ứng PCR tiếp theo.

4.3. Kết quả sao mã mRNA của gene EGFR trên mô u xơ tuyến vú và mô ung thư biểu mô tuyến vú

Trong nghiên cứu này, mức độ sao mã của gene EGFR được đánh giá dựa vào kết quả của kỹ thuật RT-PCR và nested- PCR bán định lượng trên mẫu cDNA của mô u xơ tuyến vú và mô UTBM tuyến vú với mồi đặc hiệu cho gene EGFR. Sản phẩm thu được sau phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút trong điều kiện hạn chế ánh sáng. Kết quả điện di thu được một băng có kích thước 322bp. Quan sát các hình 1,2 chúng ta thấy đậm độ vạch sản phẩm thu được sau phản ứng PCR ở những mẫu ung thư rõ hơn nhiều so với mẫu mô bệnh vú lành tính. Đồng thời khi so sánh tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng PCR của gene EGFR so với gene nội chuẩn GAPDH thì nhận thấy tỷ lệ này ở mẫu mô ung thư biểu mô tuyến vú cao hơn nhiều so với mẫu mô u xơ tuyến vú. Và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này gợi ý rằng gene EGFR được tăng cường sao mã ở mô ung thư biểu mô tuyến vú trong khi đó sản phẩm của sự sao mã thấp hơn nhiều ở mô u xơ tuyến vú.

Mức độ chính xác của sự sao mã EGFR ở mô ung thư và u xơ tuyến vú được đánh giá bằng cách tính giá trị ngưỡng (cut – off point) của tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng PCR của gene EGFR so với gene nội chuẩn GAPDH bằng phần mềm Med.Cal 12.7 áp dụng thuật toán đường cong ROC. Chúng tôi tính toán được giá trị ngưỡng (cut – off point) của tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng EGFR/GAPDH là 0,97. Tương ứng với độ nhạy là 81,53%, độ đặc hiệu là 93,75%. Như vậy, những trường hợp nào mức độ sao mã mRNA của gene EGFR ≥ 0,97 thì nghĩ đến ung thư và những trường hợp nào mức độ sao mã của mRNA của EGFR < 0,97 thì chưa nghĩ đến ung thư.

Trong nghiên cứu của Mothaffar F. và cộng sự(2010) chỉ ra rằng EGFR tăng cường sao mã và biểu lộ dương tính trong 475 trên 2567 (18%) bệnh nhân ung thư vú. Sự tăng cường sao mã và biểu lộ quá mức của gene EGFR hay gặp ở người trẻ, người da đen, liên quan với nồng độ của các thụ thể hormon và sự tăng sinh của khối u.

Nghiên cứu của Rohit Bhargava chỉ ra rằng việc tăng cường sao mã mRNA có liên quan mật thiết với sự biểu lộ của protein EGFR trong ung thư biểu mô tuyến vú.

Tác giả Đặng Thị Tuyết Minh (2008) nhận thấy gene EGFR được tăng cường sao mã mạnh ở những mô UTBM tuyến vú so với mô u xơ lành tính.

Kết quả nghiên cứu của Phan Thị Minh Phương (2010) cũng đã ghi nhận rằng mRNA  của gene EGFR được tăng cường sao mã ở mô UTBM tuyến giáp trong khi đó lại sao chép rất kém ở mô bướu giáp keo lành tính.

Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về mức độ sao mã của EGFR trong UTBM tuyến vú tương tự như kết quả nghiên cứu của các tác giả khác ở trong và ngoài nước mặc dù chỉ thực hiện bằng phương pháp bán định lượng với các sinh phẩm không quá đắt tiền. Điều này cho thấy rõ ràng EGFR được tăng cường sao mã mạnh mẽ trong các ung thư biểu mô, đặc biệt là UTBM tuyến vú. Tín hiệu EGFR tăng cao trong tế bào ung thư có thể là một yếu tố quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển tế bào ung thư, ngăn chặn sự chết theo chương trình và tạo thuận lợi cho tiến trình di căn theo các cơ chế khác nhau. Việc thay đổi hoặc khóa một giai đoạn nào đó trong tiến trình này chính là đích nghiên cứu tạo thuốc điều trị ung thư .

5.KẾT LUẬN

Những kết quả nghiên cứu trên cho phép rút ra một số kết luận sau:

- Tăng cường sao mã của gene mã hóa cho EGFR ở mô ung thư biểu mô tuyến vú.

- Mức độ sao mã của gene EGFR ở bệnh nhân UTBM tuyến vú tăng cao gấp 1,63 lần so với u xơ tuyến vú. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê.

- Tỷ lệ nồng độ DNA sau phản ứng RT- PCR của gene EGFR/GAPDH ≥ 0,97 nghĩ đến ung thư vú và không nghĩ đến ung thư vú khi <0,97.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      Đặng Thị Tuyết Minh, Trần Vân Khánh (2008), “Đánh giá mức độ sao chép mRNA của EGFR ở mô ung thư tuyến vú”, Tạp chí nghiên cứu y học, tập 5 (số 6), trang 29- 33.

2.       Phan Thị Minh Phương (2010),  “Xác định con đường tín hiệu MAPK trong ung thư biểu mô tuyến giáp”, luận án tiến sĩ y học, trường Đại học Y Hà Nội, trang 31- 45.

3.      Phạm Hùng Vân (2009), “ Polymerase Chain Reaction- Các vấn đề cơ bản”, PCR và real- time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học, trang 9- 24.

4.      Bhargava Rohit, Gerald L. William et al (2005), “EGFR gene amplification in breast cancer: correlation with epidermal growth factor receptor mRNA and protein expression and HER-2 status and absence of  EGFR- activating mutations”, Modern Pathology 2005, 18, pp.1027-1033.

5.      Luca De Antonella, Sandro Pignata et al (2000), “ Detection of  Circulating Tumor Cells in Carcinoma Pateints by a Novel Epidermal Growth Factor Receptor Reverse Transcription- PCR Assay ”, Clinical Cancer Research, pp 1439- 1445.

6.       Mothaffar F. Rimawi et al (2010), “EGFR Expression in Breast Cancer Association with biologic phenotype and clinical outcomes”, Cancer 2010, 116(5), pp.1234-1242.